神经元通信依赖于神经元化学模式与电模式的协同作用。因此，利用高时空分辨率的技术来阐明神经化学事件与动作电位之间的关联，对于全面理解大脑功能的复杂性至关重要。本研究将电偶氧化还原电位法与电生理记录集成到一个16位点金微电极阵列上，其中一个位点用于指示抗坏血酸浓度，其余金位点则用于单单元活动评估。电化学探测位点用单壁碳纳米管进行修饰，以促进抗坏血酸在低过电位下的电子转移动力学，从而增大自发抗坏血酸/氧气电池反应的驱动力。由此得到的基于电偶氧化还原电位法的微电极阵列输出与抗坏血酸对数浓度呈线性关系的开路电位，并对一系列共存的电活性物质表现出高选择性。此外，在大鼠脑中同时进行抗坏血酸的电偶氧化还原电位法传感和单单元记录时，未观察到两个记录系统之间存在相互干扰。通过在对播性抑制期间同步实时测量多个神经元群体的抗坏血酸释放和电活动，证明了基于电偶氧化还原电位法的微电极阵列的体内可行性。我们基于电偶氧化还原电位法的微电极阵列传感器为在更大维度上实现神经化学模式的高通量筛选或绘图，并将其与跨空间尺度的神经元功能关联起来创造了新的机遇。
一、介绍
中枢神经系统由异质性神经元网络通过突触连接构成，电信号与化学信号在此参与神经元通信，从而实现信息传递。为此，在生理与病理事件中对神经化学动态与神经元电活动相互作用的体内分析，将推动当前对大脑功能的理解，并指导未来神经疾病的诊断与治疗。迄今为止，已有集成方法尝试获取与神经元活动相关的两类信号。对于化学测量，基于微电极的体内电化学传感技术以其高选择性、灵敏度及时空分辨率脱颖而出。对于电生理记录，碳纤维电极或微电极阵列已被证明是捕获细胞外动作电位的可靠工具。结合这些技术，目前主要采用两种代表性策略来同步记录电化学与电生理信号，即串联策略与并联策略。前者使用单根碳纤维电极从神经元同一位置交替采集电化学与电生理信号，但可能难以避免欠采样与电伪影等问题。对于后者，通常采用多个紧密排列的微电极同时监测神经化学动态与动作电位。
展开剩余89%随着微加工技术的发展，高密度微电极阵列已展现出优异性能，能够同时记录数百个神经元的动作电位并以高通量方式测量化学浓度。此外，通过合理修饰电极表面（如采用生物识别元件或电催化剂），微电极阵列可对目标分子实现高选择性检测。相较于单根碳纤维电极，微电极阵列有助于揭示神经化学事件与电信号传递之间的时间关联，因此在多模态脑分析的最新进展中受到日益广泛的关注。
快速扫描循环伏安法、差分脉冲伏安法及安培法等电化学技术已用于神经化学物质的体内监测。这些传统分析方法依赖于在合适电位波形极化下测量分析物在电极表面氧化还原反应产生的电流，因此其传感性能（即灵敏度与稳定性）很大程度上取决于微电极的电活性面积。然而，将微电极植入脑组织不可避免地会导致蛋白质在探测表面非特异性吸附，进而降低传感器的灵敏度与使用寿命。除了致力于防止电极生物污染的研究外，我们近期研究提出的电偶氧化还原电位法概念为突破这一局限提供了新思路。与伏安法或安培法传感器不同，电偶氧化还原电位法传感器可自发输出与分子浓度呈能斯特关系的开路电位，其灵敏度独立于微电极表面积，特别适用于脑化学的连续原位分析。此外，开路电位测量在探测位点施加趋近于零的电流，从而降低了影响神经元或引发多路微电极间串扰的风险。因此，基于微电极阵列构建的电偶氧化还原电位法传感器在并行量化神经元电活动与细胞外神经化学动态方面展现出巨大潜力，但针对该集成方法在脑科学研究中的应用仍有待探索。
本研究基于电偶氧化还原电位法开发了一种可植入式微电极阵列传感器，实现了电化学信号与单单元记录的同步采集。选择抗坏血酸作为模型神经化学物质进行分析，因其在调节神经传递与脑功能中具有关键作用。我们证明经单壁碳纳米管修饰的微电极阵列记录位点对体内抗坏血酸传感表现出高稳定性与选择性。通过集成电生理记录功能，该基于电偶氧化还原电位法的微电极阵列被用于同步监测大鼠皮层扩散性抑制期间的阶段性抗坏血酸变化与单单元动作电位，证实其可作为阐明中枢神经系统化学信号与电信号实时关联的可靠传感平台。
二、实验部分
01.试剂与溶液
抗坏血酸、多巴胺、尿酸、5-羟色胺、3,4-二羟基苯乙酸及肾上腺素均购自相关供应商并直接使用。单壁碳纳米管购自专业公司，使用前经硝酸与硫酸混合溶液回流纯化。悬浮液在40℃水浴中超声处理3小时，离心后以超纯水洗涤至中性pH，真空干燥过夜获得单壁碳纳米管粉末。人工脑脊液由氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、氯化镁、碳酸氢钠、硫酸钠及氯化钙溶于超纯水配制，pH值调节至7.4。其他分析纯及以上规格化学品购自相应供应商。所有水溶液均使用超纯水配制。除特别说明外，实验均在室温下进行。
02.仪器与测量
循环伏安测试采用电化学分析仪，以制备的微电极阵列为工作电极，铂丝为对电极，饱和氯化钾银/氯化银电极为参比电极。电位测量采用高阻抗电压表或计算机控制恒电位仪。电刺激通过A.M.P.I. Master-9 SDK系统实施。单单元动作电位记录采用专业电生理记录系统完成。
03.微电极阵列制备
16记录位点金基微电极阵列购自研究机构。制备流程简述如下：以绝缘体上硅晶圆为基底，通过等离子体增强化学气相沉积法沉积二氧化硅绝缘层。蒸发并图案化钛/金层形成连接导线。再次沉积二氧化硅层实现金属层与组织液绝缘。溅射金纳米颗粒并图案化形成平面记录位点。最后通过电感耦合等离子体刻蚀形成30微米厚、2×8排布阵列，相邻电极间距100微米，单个位点直径20微米。采用微阵列点样仪在选定金记录位点修饰单壁碳纳米管水分散液用于脑内抗坏血酸选择性检测，其余裸露位点记录电生理信号。阵列经乙醇与水充分冲洗后，在硫酸溶液中以循环伏安法电化学活化。
04.参比电极制备
玻璃毛细管经微电极拉制仪拉制成两支锥形微管，尖端直径2-5微米。微管反向灌注人工脑脊液，从开口端小心插入铂丝，电极尖端与锥形孔道间距至少5厘米。
05.体内实验
成年雄性实验大鼠购自专业公司。动物饲养遵循12小时光暗周期，自由摄食饮水。所有动物实验方案均经相关机构实验动物管理与使用委员会批准实施。实验时通过气体泵输送麻醉剂麻醉动物并固定于立体定位仪。将制备的微电极阵列按标准立体定位程序植入大鼠皮层，参比电极置于硬脑膜处。在显微镜下将连接Master-9系统的双极刺激电极植入距单壁碳纳米管修饰微电极阵列3毫米处并调节至相同深度。通过刺激电极施加连续单相电流脉冲诱导皮层扩散性抑制。电生理信号以25千赫兹采样率采集，并施加250赫兹高通滤波器观察神经锋电位。
三、结果与讨论
01.基于电偶氧化还原电位法的微电极阵列设计
如图1所示，研究人员选取微电极阵列上的一个金位点（编号为第9位）作为抗坏血酸的指示电极，其余15个金位点则用于监测神经元的电活动。通过高阻抗电压表连接微电极阵列与铂参比电极，测量其间因微小电流流经外电路而产生的电位差。
图1. 基于电偶氧化还原电位法的微电极阵列传感器示意图。该装置选取微电极阵列上第9号位点作为指示电极，其余位点均作为电生理记录位点（注：微电极阵列位点编号由供应商提供）。封装于充满氧饱和人工脑脊液的玻璃微管内的铂丝作为参比电极。
在电化学反应层面，抗坏血酸在指示电极处被氧化为脱氢抗坏血酸，同时氧气在参比电极处被还原为水。整个电池反应符合自发进行的电偶反应要求，无需外部能量供给，并根据我们近期的研究报道，其产生的开路电位输出遵循能斯特方程。只要参比电极的电位保持恒定，开路电位即与抗坏血酸浓度的对数呈线性关系。
其中C为常数，k值为RT/(2F)对应29 mV，代表探针的理论灵敏度。
为稳定参比电位，我们将铂丝置入充满人工脑脊液的通气玻璃微管中，该体系可提供持续稳定的氧气供给。微管锥形尖端直径为2-5微米，能有效阻止中枢神经系统中电活性神经化学物质（如抗坏血酸、3,4-二羟基苯乙酸、多巴胺、肾上腺素及尿酸等）向参比电极表面的扩散。
深圳市富临神通科技有限公司（原“东莞市富临塑胶原料有限公司”）是 AMPI中国代理商，我们为客户提供Master-8、Master-9等电刺激产品。
02.微电极阵列修饰
抗坏血酸属于内层氧化还原物种，其电子转移动力学受电极表面化学性质调控。我们首先研究了抗坏血酸在未经修饰的第9号金位点的电化学行为。如图2C所示，抗坏血酸氧化的起始电位超过0.0伏（相对于饱和氯化钾银/氯化银电极），且电流响应呈现拖尾现象。这种缓慢的电子转移可能源于脱氢抗坏血酸对电极表面造成的不可逆污染。已有研究表明，采用碳纳米管等电催化材料修饰电极表面可有效增强抗坏血酸氧化的电子转移动力学。基于此考虑，我们在微电极阵列的第9号位点修饰了单壁碳纳米管。在单壁碳纳米管修饰的金电极上，抗坏血酸的氧化电流起始于约-0.10伏，并在约0.0伏达到稳态。通过降低过电位促进抗坏血酸氧化，将显著增强构建抗坏血酸/氧气电偶电池的驱动力，同时防止其他电活性干扰物质对开路电位产生显著贡献，从而提高体内传感的选择性。
图2. 微电极阵列第9号位点在单壁碳纳米管修饰前（A）与修饰后（B）的光学照片。该位点在修饰前（C）与修饰后（D）记录的循环伏安曲线。电化学测试在人工脑脊液中进行，分别记录不含抗坏血酸（红色曲线）与含有500 μM抗坏血酸（黑色曲线）条件下的响应。扫描速率为50 mV/s。
03.基于电偶氧化还原电位法的微电极阵列体外与体内验证
通过体外实验验证了该微电极阵列探针检测抗坏血酸的实际可行性。我们向溶液中依次加入系列浓度抗坏血酸并记录开路电位的实时响应。如图3A所示，加入抗坏血酸后开路电位在毫秒级时间内迅速上升，并在约5秒内达到平衡。此响应速度使得基于电偶氧化还原电位法的微电极阵列能够监测体内持续数秒至数小时的抗坏血酸浓度变化。在10 μM至500 μM浓度范围内，稳态开路电位与抗坏血酸对数浓度呈线性关系，该范围涵盖了中枢神经系统中抗坏血酸的生理浓度水平。
大脑中多种共存电活性物质也可能在低于铂参比电极上氧气还原电位的电势下自发氧化。因此，为模拟大脑真实环境，研究人员在存在抗坏血酸的条件下监测微电极阵列对潜在干扰物质的实时开路电位响应，以评估其对抗坏血酸的选择性。如图3B所示，首先在人工脑脊液中建立250 μM抗坏血酸的稳态开路电位，随后加入处于中枢神经系统生理浓度水平的电活性物质，这些干扰物的添加均未引起明显的开路电位扰动，证明该基于电偶氧化还原电位法的微电极阵列对抗坏血酸传感具有优异选择性。根据研究，这种选择性可从自发电化学反应的驱动力角度进行解释：指示电极与参比电极间较大的电位差有利于相应反应物快速建立完整的电池反应。与其他电活性分子相比，抗坏血酸在单壁碳纳米管修饰指示电极上的氧化反应与氧气的还原反应共同构建了更大的自驱动力，从而有效稳定电偶氧化还原电位法电池体系，避免其他氧化还原分子对开路电位造成干扰。
进一步地，我们将微电极阵列与参比电极共同植入大鼠皮层，以探究电偶氧化还原电位法传感器在体内的稳定性。如图3C所示，在大鼠脑内连续记录过程中，抗坏血酸的开路电位测量未出现显著变化。综上所述，这些结果证明了我们设计的基于电偶氧化还原电位法的微电极阵列在后续体内实时抗坏血酸传感中的可靠性。
图3. （A）基于电偶氧化还原电位法的微电极阵列传感器对10 μM至500 μM浓度梯度抗坏血酸添加所记录的开路电位响应。插图：开路电位响应与抗坏血酸对数浓度的关系曲线。（B）在含0.25 mM抗坏血酸的人工脑脊液中，传感器对后续添加的10 μM多巴胺、10 μM尿酸、10 μM 5-羟色胺、10 μM 3,4-二羟基苯乙酸、10 μM肾上腺素及100 μM抗坏血酸的开路电位响应。（C）植入大鼠皮层的基于电偶氧化还原电位法的微电极阵列记录的对抗坏血酸的开路电位响应。
04.电偶氧化还原电位法传感与电生理记录的相互影响
这种新型电化学技术的应用是否会干扰邻近神经元的电活动，或直接影响电生理记录系统，是多模态脑分析的关键问题。为阐明这一问题，我们利用微电极阵列同步测量了抗坏血酸动态变化与单单元活动。结果显示，在正常状态下通过15个裸露金微电极连续监测不同深度神经元的单单元活动持续180秒。在此期间，单壁碳纳米管修饰金位点进行的电偶氧化还原电位法传感在t=60秒时启动，t=120秒时关闭。通过进一步对检测到的神经元进行信号分类分析，发现电位测量前、中、后三个阶段的神经锋电位发放频率无统计学差异。这表明开路电位记录对电生理记录未产生持续性兴奋或抑制效应，反之亦然，从而证明基于电偶氧化还原电位法的微电极阵列可作为双功能探针并行工作，且紧密排列的通道间无任何串扰。
与之形成对比的是，当电化学记录位点在安培模式下恒定偏置+30 mV电位时，可观察到锋电位发放频率出现无法预测但在统计学上显著的改变。由此可见，电偶氧化还原电位法传感技术因其仅向被测脑组织输送趋近于零的电流，在实现与单单元活动记录并行化方面具有独特优势。通过单一微电极阵列实时整合电偶氧化还原电位法与电生理技术，为无需复杂系统构建或仪器配置即可克服此类干扰提供了新途径。
图4. （A）探针布置示意图。微电极阵列与参比电极共同植入大鼠皮层。（B）电生理记录期间指示电极在60秒内记录的开路电位随时间变化曲线。（C）微电极阵列记录的典型细胞外动作电位波形。蓝色与红色箭头分别表示电化学记录的开启与关闭时刻。
05.SD期间大鼠皮层抗坏血酸释放与单单元活动的同步测量
被称为皮层扩散性抑制的细胞去极化波已被证实与偏头痛先兆、创伤性脑损伤、中风及其他神经系统疾病相关。这种缓慢传播于脑组织的波动可引起神经元电活动的显著变化，并伴随多巴胺、谷氨酸及抗坏血酸等神经化学物质的释放。因此，我们进一步利用基于电偶氧化还原电位法的微电极阵列同步探测SD期间皮层抗坏血酸动态与神经电活动的实时关联。
将刺激电极置于距离微电极阵列约3毫米处，施加持续5秒的600微安电脉冲以诱导大鼠皮层发生SD。典型结果显示，电刺激后约45秒时，指示抗坏血酸释放的开路电位值开始快速上升，并在数秒内达到峰值，随后逐渐回落至基线水平。该结果与我们先前关于SD引发抗坏血酸快速爆发的观察高度吻合，推测其机制可能是通过细胞肿胀激活容积敏感性有机阴离子通道。
在开路电位升高的同时，记录到邻近神经元异常放电活动持续约2秒，这表明SD期间神经元去极化与神经化学物质释放存在协同效应。这一观测结果凸显了基于电偶氧化还原电位法的微电极阵列通过同步测量神经化学动态与电生理事件，直接解码脑化学与神经生理学时间关联的强大能力。需特别说明的是，2号和5号位点的峰值频率出现约4秒延迟。这种阵列电极记录电信号的时间差可归因于传播波从刺激探针缓慢扩散至各记录位点的距离差异。
图5. （A）基于电偶氧化还原电位法的微电极阵列与SD诱导探针共同植入大鼠皮层的示意图。刺激电极位于距微电极阵列3毫米处。电刺激（蓝色实心矩形标示，600 μA，5 s）后通过微电极阵列同步测量的抗坏血酸浓度变化（B）及4个皮层神经元锋电位发放频率（C）。统计直方图时间窗宽为1秒。
四、结论
总之，我们提出了一种基于电偶氧化还原电位法的新型微电极阵列平台，能够在高时空分辨率下实现神经元电活动与细胞外抗坏血酸浓度变化的体内同步测量。该可植入式微电极阵列有助于精确调控电化学与电生理记录位点间的距离，使两种记录模式能够在相同微环境中工作。基于开路电位原理，电偶氧化还原电位法不会对电生理采样造成电学干扰，从而使得两个并行记录系统能够在活体大脑中独立且同步运行。
该技术不局限于抗坏血酸检测，基于电偶氧化还原电位法的微电极阵列还有利于在不涉及电极串扰问题的情况下，实现多种神经化学物质的多通道同步监测。因此，本研究为基于电偶氧化还原电位法的微电极阵列在揭示多样化神经化学物质与神经元电活动集群的真实网络方面展现了广阔前景。
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